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二、生物素的理化性质与标记
生物素及其活化
生物素经活化后，可容易地与各种抗原、抗体、酶及核酸分子中相应基团偶联形成生物素化标记物。目前已有商品生物素标记试剂出售，使BAS放大系统得以广泛地应用于免疫化学、分子生物学及生物化学等领域的分析测定技术。
以下介绍几种常用于标记不同类型生物大分子的活化生物索的制备及特性：
①标记蛋白质氨基的活化生物素
此种活化生物素的制备方法是将生物素与N－羟基丁二酰胺在碳二亚胺的作用下进行缩和，生成生物索素N－羟基丁二酰亚胺酯（biotiny-N-hydroxy-succinimide，BNHS）。BNHS分子酯健中的-C=O基团可与蛋白质分于中赖氨酸的氨基形成肽键，从而使蛋白质标记上生物素。若蛋白质含赖氨酸残基多，且等电点PI＞6时，标记效果好。因此，BNHS适用于对抗体和中性或偏碱性抗原的生物素标记。
生物素的分于量较小，当与抗体或酶反应形成生物素标记结合物后．由于大分子蛋白的空间位阻效应（steric hindrance），可对生物素与亲和素间的结合以及BAS的应用效果造成干扰。可通过在生物素分子侧链上连接一定数量的基团，形成连接臂，增加生物素与被标记大分子间的距离（如长臂活化生物素），减少位阻效应，增加检测的灵敏度和特异性。
长臂活化生物素（N-hydroxy-succinimido-6-biotinyl amido hexanoate，BCNHS）是在生物素和N—羟基丁二酰亚胺之间添加了两个6-氨基己糖分子基团，形成连结臂，使其与抗体、酶等生物大分子结合后，不受位阻效应的影响，更易发挥生物索的活性作用。BCNHS的制备是先用6－氨基己糖与生物素连接制得长臂生物素，然后再将其活化。
②标记蛋白质醛基的活化生物素
用于此类标记的活化生物素有两种：生物素酰肼（biotin hydrazine，BHZ）和肼化生物胞素（biocyin hydrazine，BCHZ）。BHZ是水合肼（hydraine hydrate）与生物素的合成物，主要用于偏酸性糖蛋白的生物素标记。也可在BHZ侧链上添加一个赖氨酸基团作为连结臂，减少标记后的空间位阻，使活化后的生物素能更好地与亲和素结合。
生物胞素（biocytin）是生物素通过-C=O基与赖氨酸的ε－氨基连接而成的化合物，它与无水肼反应后形成的肼化物即为肼化生物胞素（biocytin hydrazine，BCHZ）。BCHZ除可与蛋白质的醛基结合外，它还与BNHS相同，能与蛋白质的氨基结合，因此其适用范围较BHZ宽。
③标记蛋白质巯基的活化生物素
3-（N-马来酰亚胺-丙酰）-生物胞素[3-（N-maleimido-propiny）-biocytin，MPB]是能特异地与蛋白质巯基结合的活化生物素试剂。它是用氯化生物胞素与3-（N-马来酰亚胺-丙酰）-N-BNHS在二甲基甲酰胺（DMF）溶液中反应后制得的。
④标记核酸的活化生物素
活化生物素可通过缺口移位法化学偶联法、光化学法及末端标记法等技术使生物素的戊酸侧链通过酰胺健与核酸分子相连构成生物索标记的核酸探针。常用于标记核酸分子的活化．常用于标记核酸的活化生物素有以下几种：
1.光生物素（photobiotin） 它是一种化学合成的生物素衍生物。生物素分子侧链上连接的芳香基叠氮化合物基团具光敏感性，在一定波长的光照射下，光敏基团可转变为芳香基硝基苯而直接与腺嘌呤N7位氨基结合，形成生物素化的核酸探针，用于DNA或RNA的标记。
2.生物素脱氧核苷三磷酸 先将生物索与某种脱氧枝苷酸连接成活化生物素，如生物素化dUTP（Bio-11-dUTP）。Bio-1l-dUTP作为TTP的结构类似物，可采用缺口移位法通过DNase和DNA聚合酶Ⅰ的作用而掺人到双链DNA中。
3.BNHS和BHZ二者均可以在一定条件下与核酸胞嘧啶分子中的N4氨基交联，使核酸分子生物素化。
采用BNHS和BHZ活化生物素标记核酸时，生物素偶联的胞嘧啶N4氨基，是碱基互补时胸嘧啶与鸟嘌呤核苷酸形成氢键的基团，该位置连接生物素后，可影响氢键的形成，因此目前常用光生物素和生物素化dUTP作为标记核酸的活化生物素。
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