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三、生物素化蛋白质衍生物
（一）生物素化蛋白质衍生物的特性
生物素通过噻吩环戊酸侧链上的羧基与多种大分子偶联活化后，可用于标记各种蛋白质（包括抗体、抗原、酶、激素及葡萄球菌Ａ蛋白等）形成生物素化蛋白质衍生物。而且一个蛋白质分子可联结多个生物素分子，从而使其具较高的比活性，在与亲和素的反应中成为多价。生物素化大分子的多价性，是BAS多级放大作用的物质基础。
生物素化蛋白质衍生物有二类，一种是生物素化的大分子生物活性物质（如抗原、抗体），另一种是标记材料（如酶）结合生物素后制成的标记物。
（二）标记方法
1.标记抗体、抗原 抗体是常用的生物活性大分子物质。由于一个抗体分子可连接多个生物素分子，因此一个生物素化的抗体分子在反应时可与多个亲和素分子结合。为适用于不同的抗原-抗体反应体系，通常选用第二抗体进行生物素标记，制备的标记物具通用性。
常用于标记抗体的活化生物素是BNHS。反应时，BNHS分子中的酯键在碱性溶液中迅速水解，C＝O基团即可与抗原或抗体蛋白质中的赖氨酸残基形成肽键，使生物素标记在抗体分子上。游离生物素只需简单的透析方法即可除去。
但对于分子偏酸性的抗原，标记时多采用BHZ：
2.标记酶 以生物素标记辣根过氧化物酶（HRP）为例：将含有生物素BNHS的N,N'-二甲基甲酰胺溶液滴加入HRP碳酸盐缓冲液中（0.1mol/L，pH8.4），使最终二反应物混合体积比为1：8，充分反应，然后用PBS透析除去末标记生物素等物质，即得到生物素化HRP。
其他可用于标记的酶有β—半乳糖苷酶（β-Gal）和碱性磷酸酶（AP）。
（三）标记注意事项
1.应根据抗原或抗体分子结构中所带可标记基团的种类（氨基、醛基或巯基）以及分子的理化性质（酸性、中性或碱性），选择相应的活化生物素和反应条件。
2.标记反应时，活化生物素与待标记抗原或抗体应有适当的比例，使每个蛋白质分于上标记的生物素分子数量控制在一定范围，以免影响标记物的活性。如标记抗体时，IgＧ的应用浓度以0.5—5μg/ml，生物素：IgG的比例（mg/mg）为2:1时．效果较好。一般每个抗原或抗体分子标记1—3或3－5个生物素分子较为适宜。
3.为减少生物素标记蛋白质后，大分于物质造成的空间位阻影响，有利于生物素与亲和素的结合，可在生物索与被标记物间加入交联臂样结构。
4.生物素与抗原、抗体等蛋白质结合后．不影响后者的免疫活性；标记酶时则结果有不同，对HRP、葡萄糖氧化酶和β－半乳糖苷酶，酶活性不受偶联生物素的干扰，但某些酶（如碱性磷酸酶）在标记生物素后，其活性会有一定程度降低。
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