生物素-亲和素免疫放大技术

六、生物素-亲和素系统的应用二

生物素—亲和素系统在ELISA中的应用

把BAS与ELISA偶联起来，可大大提高ELISA测定的灵敏度．因为亲和素与生物素间极高的亲和力，使反应结合更牢固稳定，而且特异性高；每个亲和素可结合４个生物素，可使反应明显放大；用小分子生物素代替酶标记抗体，可减少反应中的空间位阻。

BAS与ELISA偶联应用的形式有多种：如用于固相化抗体或抗原的制备．即是先将亲和素（或链霉亲和素）包被于固相载体，抗体或抗原也先与生物素结合，然后通过亲和素—生物素反应而使生物隶化的抗体或抗原固相化：这种包被法不仅可增加固相载体上的抗体或抗原包被量，而且使其结合位点充分暴露，有利于免疫反应的有效进行。BAS亦可用于ELISA终反应的放大：用生物素化的抗体替代常规ELISA中的酶标抗体，然后连接亲和素-酶结合物（BA-ELISA）、或亲和素及酶标生物京（BAB-ELISA）或ABC试剂（ABC-ELISA），从而使反应信号放大，提高检测灵敏度。下图所示的即是一种BAB反应模式的BAS应用于双抗体夹心法ELISA检测抗原的原理及过程。

生物素-亲和素系统在均相酶免疫测定

BAS除了作为免疫测定的放大系统外，还可作为均相酶免疫测定（HEI）中高效的酶活性调变系统。在BAS—HEI系统中，预先将作为配体的生物素与酶偶联，形成的生物素－酶复合物具有完整的酶活性；亲和素作为特异的酶结合体（类似于抗体），可与生物素-酶复合物结合。经典的抗体结合酶抑制性均相酶免疫分析类似，当生物素-酶复合物与亲和素结合后，酶活性中心受空间位阻作用而失活． HEI为竞争性结合反应，因此反应系统中，同时加行生物素－酶，亲和素-抗原，特异性抗体和待测抗原：由于抗体限量，于是待测抗原和亲和素-抗原复和物竞争与抗体结合。亲和素—抗原与抗体结合后．即不能与生物素-酶复合物结合，后者的酶活性得以保留；而游离的亲和素—抗原则可结合生物素－酶复合物，井使后者酶活性丧失。因此．反应体系中待测抗原浓度越高，则游离的亲和素-抗原复合物越多，最终测得的酶活性越低，即酶活性的变化与待测标本中抗原浓度呈剂量相关。

生物素-亲和素系统在荧光免疫技术中的应用

荧光免疫分析（fluorescence immunoassay，FIA）是发展最早的一种标记免疫技术。FIA按实际用途可分为两大类：一种是经典的以荧光物质标记抗体，主要用于组织和细胞中抗原、抗体的定位观测，称之为荧光抗体技术（fluorescent antibody technique）；另一类则是用于液体样本中微物质定量的荧光免疫分析技术，如时间分辨荧光免疫分析（time-resolved fluorescence immunoassay，TRFIA）或荧光偏振免疫分析（fluorescence polarization immunoassay FHA）等。

BAS用于荧光抗体技术．通常采用BA法，即用荧光素直接标记亲和素(或链霉亲和素）；也可采用游离亲和素（或链霉亲和素）搭桥，两端分别连接生物素化抗体和荧光素标记的生物素（BAB法）或荧光标记的抗亲和素（或链霉亲和素）抗体的夹心法。与常规荧光抗体法相比，引入BAS的荧光抗体技术可明显地提高方法的灵敏度和特异性。

TRFIA发展至今已有几种分析体系，其中与传统的解离增强镧系元素荧光免疫分析（disso-ciation enhanced lanthanide fluoroimmunoassay ，DELFIA）不同，Cyber Fluor时间分辨荧光免疫分析（Cyber Fluor time-resolved fluoroimmunoassay ，TRFIA）和酶放大时间分辨荧光免疫分析（enzyme-am-plified time-resolved fluoroimmunoassay ，EATRFIA）均将BAS引入反应测定过程，利用其特异的生物放大功能，提高测定的灵敏度：现以双位点夹心法实验为例，简介其工作原理如下：

Cyber　Fluor　TRFIA采用的是一种新型双功能螯合剂，称为4，7－双(氯碱酰基苯基)-l，10—菲咯啉-2，9-二羧酸[4,7—bis（chlorosulfophenyl）-1，10-phenanthroline-2，9—dicarboxylic acid，BCPDA].用BCPDA做“桥”，一端连接链霉亲和素（SA）。另一端螯合Eu3＋；制成通用试剂SA—BCPDA—Eu3+；此外，将两株ＭcAb分别固相化和生物素化。反应完成后形成的复合物为：固相McAb—Ag-（McAb-生物素）-（SA—BCPDA-Eu3+），即通过生物素与链霉亲和素间高亲和力的结合，把通用试剂与固相载体上的双抗体夹心免疫复合物相连接，并且特反应信号放大。

EATRFIA则是在抗原与固相McAb和生物素化McAb反应形成夹心复合物后，加入碱性磷酸酶（ALP）标记的SA（ALP-SA）继续反应，经生物素和SA的高亲和力结合，形成复合物：固相McAb-Ag－（McAb-生物素化）-（SA-ALP）。ALP再作用底物生成产物5-氟水杨酸，后者在碱性条件下，可与Tb3+-EDTA形成荧光寿命长且产额高的三元复合物用于检测。EATRFIA是汇集了酶放大作用，BAS的高亲和力和生物放大作用以及TRFIA优点的新一代高灵敏度、不用增强液的分析方法。

生物索-亲和素系统在放射免疫测定中的应用

BAS主要与免疫放射分析（IRMA）检测体系偶联，用于对终反应的放大（BA法）：先将针对不同抗原决定簇的固相抗体和生物素化抗体与抗原（标准抗原和待测抗体）同时反应，在固相载体表面形成双抗体夹心免疫复合物；再加入125I标记的亲和素（或链霉亲和素）与复合物中的生物素结合，最终使反应信号放大，进一步提高IRMA的灵敏度。如该系统用于测定促甲状腺激素（TSH）时，由于方法的高灵敏性，即可将甲亢患者降低的TSH水平与正常值低限有效地予以区别。此外，BAS也可用于IRMA反应后B、F成分的分离：先将生物素化的McAb和放射性核素标记的McAb与抗原的不同抗原决定簇结合，反应平衡后，加入表面偶联有亲和素的聚苯乙烯珠与免疫复合物中的生物素连接成固相终产物。该法的优点是克服了其他IRMA法需多次离心的麻烦．待测复合物与固相结合更牢固，操作更简便。

生物素—亲和素系统在分子生物学中的应用

BAS在分子生物学领域中的应用日渐增多，目前主要集中在以生物素标记核酸探针进行的定位检测，用BAS制备的亲和吸附剂进行基因的分离纯化以及将免疫测定技术与PCR结合建立免疫—PCR（immuno-PCR）用于抗原的检测等三方面：

自从合成了生物素化的脱氧三磷酸脲苷（dUTP）和UTP等核苷酸单体以来，以生物素化多核苷酸为探针的核酸杂交技术有了很大发展。生物素标记核酸探针常用于Southern、Northern和原位杂交等。实验时，标记探针先与细胞或染色体原位（或是固定在乙酸纤维素膜上）的变形核酸分子进行杂交，然后用偶联了酶或荧光物质的亲和素（或链霉亲和素）识别杂交互补片段．使其显色或产生荧光。这种非放射性标记技术具有灵敏、安全。简便快速和经济的特点，并且克服了放射性核索探针标记与检测的缺点，应用潜力巨大。

利用BAS与磁化微球技术联合进行mRNA的分离和提纯：先用生物素标记的寡脱氧胸腺嘧啶核苷酸[Oligo（dT）]和总RNA杂交，再用包被链霉亲和素的磁珠捕获mRNA，经磁性吸附，将mRNA—磁珠混合物一并分离，然后将分离的mRNA洗脱收集。这种生物磁珠分离法较传统的用带Oligo（dT）的纤维素或琼脂糖亲和层析分离法更加有效、方便。

免疫-PCR是将抗原－抗体反应的高度特异性与PCR技术的高度敏感性相结合建立的迄今最敏感的分析方法，其检测灵敏度可达10-21ml水平，免疫-PCR的技术关键在于用一个连接分子将一段特定的DNA连接到抗体上，在抗原和DNA间建立对应关系，从而将对蛋白质的检测转变为对核酸的检测。如用链霉亲和素（SA）-蛋白A嵌合体作为连接分子，它的蛋白A和SA可分别与IgＧ的Fc段和生物素化DNA中的生物素结合，从而在蛋白质和核酸之间建立起对应关系，经PCR扩增，即可将抗原抗体反应的特异性高度放大。此外，为解决传统PCR扩增产物检测方法操作繁琐、灵敏度低和耗时的不足，现又有用ELISA方法来定量检测，免疫-PCR扩增产物，称为PCR-ELISA。它主要是用一对分别标记了生物素和地高辛的引物来扩增标记DNA，亲和素则作为捕获抗体以固定扩增产物，再用标记有碱性磷酸酶的抗地高辛抗体进行双抗夹心ELISA检测扩增产物。结果显示，此种方法的测定灵敏度、精密度和稳定性均优于传统方法，而且PCR-ELISA更节省时间和更易于临床检测的自动化。

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