免疫印迹技术

三、样本的制备2

快速裂解酵母细胞制备样本

使用这种方法会使蛋白质变性，在所用抗体能识别变性靶蛋白时才能使用这一方法。

[试剂与设备]

（1）待检测的酵母菌。

（2）25%三氯乙酸（TCA）

（3）1%SDS。

（4）丙酮。

（5）RIPA缓冲液：

50mmol/L Tris—HCl（pH7.5）

150mmol/L NaCl

1% Nonidet P-40 （NP-40）

0.5% 去氧胆酸钠

0.1% SDS

（6）玻璃珠（直径0.45—0.50mm）。

（7）台式离心机。

（8）水浴箱。

（9）涡漩振荡器。

（10）加样器与吸头等。

[操作步骤]

（1）0°C以12000g离心lmin，从lml培养物中收集细胞，弃上清液（当靶细胞为分泌型蛋白时除外）。

（2）用0．5ml 25%三氯乙酸（TCA）重悬细胞。

（3）按步骤1离心回收细胞，重悬于1ml 90%丙酮中。

（4）按步骤（1）离心，估算沉淀物体积，加入等体积1%SDS重新悬浮沉淀物。

（5）加入经酸处理的玻璃珠（直径0．45—0．50mm）至溶液的弯月面处。

（6）振荡悬液5次，每次间歇期间将悬液置于冰浴中冷却lmin，在相差显微镜下监测细胞

（7）用一烧红的皮下注射器针头（23号）在微量离心管的顶盖上穿一小洞，以防加热过程中玻璃球冲出离心管。

（8）在沸水浴中加热3min。

（9）把玻璃珠转移到另一个微量离心管中，用0.5ml RIPA缓冲液洗涤原离心管，并把洗液合并于内装玻璃珠的管中。

（10）在微量离心管底部打一小洞，回收细胞提取液，这一操作使用烧红的皮下注射器针头效果最佳。把仍装载玻璃球的微量离心管置于另一空微量离心管上，把如此重叠的一对微量离心管，于4°C以2000g离心2min。

（11）回收下面一只内有细胞提取液的微量离心管，于4°C12以2000g离心5min，使提取液澄清，移出上清液置于另一个微量离心管中，—20°C贮存备用。

[注意事项]

酵母细胞提取液储存于—20°C一般是稳定的，但是，如果待测蛋白被水解，则应在提取液中加入蛋白酶抑制剂，并保存于0°C。

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