免疫印迹技术

九、免疫检测

免疫检测主要取决于抗原抗体的特异性，特别是能够识别膜上变性的和固定化抗原的抗体。因印迹膜上有非特异性吸附蛋白质的位点，因此需进行封闭以防免疫试剂的非特异性吸附。将印迹膜与一定浓度的不参与特异性反应蛋白质或去污剂溶液孵育可实现封闭。然后通过抗体与膜上抗原的特异性结合来定位抗原。抗原可用易观察的标记的抗体进行检测。抗体本身可以标记，直接用于检测抗原，但更为常见的是，使用的抗体是非标记的，而用标记的二抗采进行抗原定位。

常用的标记方法有酶联法，一般是用辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶，具体的介绍见本书第四章“免疫标记技术”。近年来，化学发光（CL）法已成为常用的方法之一。该法是基于环化二脂酰肼（cyclic diocyhydrazide）的化学氧化作用，生成一种不稳定的中间产物，当其衰变时即可发光。发出的光可使标准X-光片感光，产生较易识别的图像。化学发光法比过去使用的显色或放射活性检测法更加灵敏。尽管对灵敏度增加的幅度还有很多争论，但一般认为比显色法大约增加20倍，比放射活性检测方法约增高7倍。该法的关键是使用了辣根过氧化物酶偶联物作为二抗或二级试剂。辣根过氧化物酶可与抗免疫球蛋白抗体、蛋白A、蛋白C或其他可与一抗特异结合的试剂共价结合。在过氧化氢存在的条件下，过氧化物酶催化鲁米诺（氨基苯二酰一肼）氧化后即可发光。

除了蛋白质样品的电泳分离过程之外，在进行免疫印迹操作之前，还考虑下面两个问题。

①印迹膜上非特异性蛋白质结合位点的封闭

②直接与间接检测方法

印迹膜上非特异性蛋白质结合位点的封闭

表4 总结了常用的封闭液及其优缺点。尽管这些封闭液在某些情况下使用较为满意，但是仍需要仔细选择以确保其能适合于检测试剂。几乎适合于所有检测系统的两种封闭缓冲液是脱脂奶粉和牛血清白蛋白。若蛋白质封闭液造成本底过高或干扰检测，则可试用吐温20封闭液。

表4 常用的封闭液

*若不愿每次新鲜配制封闭缓冲液，应加入0.01%硫柳汞制剂作为防腐剂。避免使用叠氮化钠，因其能抑制辣根过氧化物酶的活性。

直接与间接检测方法

直接法是指用标记的第一抗体（一抗）来进行检测的方法，用这种类型的抗体对膜上抗原进行免疫检测的本底较低，并且在同一张印迹膜上可同时使用来源或特异性不同的多种抗体，但灵敏度不如间接法。间接检测是指先使用非标记的一抗，然后用可与一抗结合的标记第二抗体（二抗）进行检测的方法。由于二抗分子是多价的，具有放大效应，因而灵敏度较高。因此，除非需要直接检测抗原的特异性，否则最好是选择间接法进行免疫印迹测定。通常选用与辣根过氧化物酶偶联的抗免疫球蛋白抗体商品试剂来检测一抗，分别针对不同种属来源的一抗。这样，一个实验室只需备用针对小鼠，大鼠，家兔和其他一抗的少数几种通用试剂即可满足各种免疫印迹实验要求。

间接检测法

[准备工作]

在准备做抗原检测时，须考虑所用一抗和二抗的最佳浓度，对不同来源的抗体，其特异性林的浓度都不相同。因此，对一抗体进行滴定有助于确定最佳反应比例，预先滴定二抗对实也有帮助，一旦确定最佳浓度，则每次印迹即可用同一批一抗、二抗来完成。多数情况下可用商家提供的浓度进行检测。

[材料与试剂]

（1）PBS：称取8g NaCl；0.2gKCl；1.44g Na2HP04和0.24g KH2PO4，加蒸馏水800ml，用HCl调节溶液pH值至7.4，加水至1L，在1.034X105Pa高压下蒸气灭菌20min，室温保存。

（2）封闭液（见表4）。

（3）1%BSA/PBS。

（4）一抗试剂和碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶标记的二抗试剂（通常是用辣根过氧化物酶标记的抗免疫球蛋白抗体）。

（5）碱性磷酸酶底物溶液:

1）NBT（氮蓝四唑）溶液:在10ml 70%的而甲基酰胺中溶解0.5gNBT。

2）BCIP（5-溴-4-氮-3-吲哚磷酸）溶液:在10ml 70%的而甲基酰胺中溶解0.5g BCIP。

3）碱性磷酸酶缓冲液：100mmol/LNaCl；5mmol/L MgCl2；100mmol/L Tris-HCl（pH9.5），置密闭容器中保存，此溶液稳定。

4）取66rdNBT溶液与10ml碱性磷酸酶缓冲液混匀，加入33plBCIP溶液。

5）辣根过氧化物酶底物溶液：用9ml的0.01mol/L Tris-Cl（pH7.6）溶液中溶解6mg 3—3，—二氨基联苯胺，加入lml 0.3％（w/v）NiCl2或CoCl2，用Whatmanl号滤纸过滤以除去沉淀，加入10yB0％H202混匀后立即使用。此溶液须在临用时配制。

[操作方法]

（1）用PBS漂洗印迹膜数次。

（2）加入一种封闭液（见表4）。注意：不同的抗原和实验方法需用不同的封闭缓冲液。例如，BSA（V部分）和牛奶都含有磷酸化的酪氨酸和生物素，用特异性抗磷酸化酪氨酸抗体进行实验时，这会给解释实验结果造成一定的混淆，也给亲合素/链霉亲合素检测的应用带来一些问题。某些牛奶制品可抑制碱性磷酸酶的活性。若无信号或检测背景较高，则需尝试不同的封闭缓冲液。

（3）室温下搅动孵育。一般孵育20min～2h或4℃过夜较好。

（4）从封闭缓冲液中取出印迹膜，用PBS漂洗3次，每次5min。

（5）加入工作浓度的一抗溶液。每张15X15cm的印迹膜用量为10ml。所有的稀释液均用含有蛋白质的溶液，例如1％BSA/PBS。孵育可在浅盘或塑料袋中进行。在室温下将抗体和印迹膜搅动孵育至少1h。有人认为4℃孵育过夜（12～18h）可提高灵敏度。

（6）用PBS漂洗印迹膜4次，每次换液洗5min。

（7）此时，印迹膜便可加人工作浓度的标记的二抗溶液。可在浅盘或塑料袋中室温孵育1h。抗体用含有蛋白质的溶液进行稀释，例如1％BSA/PBS。商品化的酶标二抗应在0.5～5μl/ml浓度之间使用（通常将商品试剂原液稀释成1：200～1:2000的应用液）。用辣根过氧化物酶标记的试剂须用不含叠氮钠的封闭液稀释。

（8）用PBS漂洗印迹膜4次，每次换液洗5min。

（9）将经漂洗的印迹膜移至另一干净浅盘中，按印迹膜面积加入0.lml/cm2的底物溶液（若使用碱性磷酸酶标记的二抗，用碱性磷酸酶底物溶液，若用辣根过氧化物酶标记的二抗则用辣根过氧化物酶底物溶液），于室温轻轻摇动，待蛋白条带的颜色深度达到要求（约2-20min），用水略为漂洗，放人PBS中。

（10）拍摄照片，留作永久实验记录（过氧化物酶染色的蛋白条带经日光照射数小时后颜色将退去）。

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