免疫印迹技术

七、将蛋白质从凝胶中转印致膜上

电泳后蛋白质样品转移的方法，包括半干式转移、湿式转移等。各种转移方法原理相似，都是将膜与胶放在中间，上下加滤纸数层，做成"Sandwich”样的转移单位，并且保证带负电的蛋白质向阳极转移，即膜侧连接阳极或面向阳极。

可用于免疫印迹的固相载体有多种，硝酸纤维素膜、尼龙膜、带正电荷的尼龙膜及PVDF（聚亚乙烯双氧化物）膜。硝酸纤维素膜最为常用，具有结合能力强，膜不需要活化，背景浅，能进行多次免疫检测并可用常规染色方法，功能基团寿命长等优点，但极易破碎不易操作。尼龙膜软且结实，较硝酸纤维素膜易操作，具有与蛋白质或蛋白质-去污剂混合物有很高的结合力，每平方厘米可结合480pg蛋白（而硝酸纤维素膜只能结合80Pg），因此灵敏度高，背景也高，因为其高电荷密度使对其非结合区进行封闭较为困难。带正电荷的尼龙膜能有效地结合低浓度的小分子蛋白，酸性蛋白、糖蛋白和蛋白多糖，当转印液中有SDS时，蛋白质容易从膜上泄漏，用甲醇固定能提高蛋白质在尼龙膜上的保留指数。PVDF膜在制备多肽供蛋白质化学分析中最为常用。在进行蛋白水解和序列分析时，通常是先将蛋白质结合在PVDF膜上。

将凝胶中的蛋白质转印至膜上的方法很多。目前常用方法是电洗脱或电印迹。其主要优点是转印迅速、完全。电洗脱有两种方法：一种是湿转印法，即将凝胶-膜夹层组合完全浸入转印缓冲液中；另一种是半干转印法，即将凝胶-膜夹层组合放在浸有转印缓冲液的吸水纸之间。前者是将夹层组合放人有铂丝电极的缓冲液槽中。而后者是将凝胶-膜夹层组合置于两个石墨平板电极之间。这两种转印的装置效果均较好，可根据实验室条件来选择。

试剂与器材

（1）电泳凝胶。

（2）转移缓冲液：pH8.1—8.4：3.03g Tris，14.4g甘氨酸，200ml甲醇充分溶解后，加双蒸水定容至1000ml。

（3）TBS缓冲液：1.21g Tris，8.77gNaCl，加HCl调pH至7.4，加水定容至1000ml。

（4）TTBS缓冲液：在TBS中加入Tween—20，浓度为0.1%，4℃保存1个月。

（5）封闭液：1.5g脱脂奶粉溶于50ml TTBS中，现用现配（用1%～3%的BSA，或10%胎牛血清亦可）。

（6）特异单克隆抗体：用封闭液适当稀释。

（7）酶标第二抗体：辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AKP）标记。

（8）蛋白质转印膜：NC（硝酸纤维素）膜、PVDF（聚偏二氟乙烯）膜，或尼龙膜等均可。

（9）显色底物。

（10）恒温振荡器。

（11）半干式电泳凝胶转移仪。

（12）Whatman 3mm滤纸。

（13）手套。

（14）孵育及显色用塑料盒。

（15）塑料袋。

（16）塑料封口机

操作步骤（半干式转移）

1.转移

（1）电泳后的凝胶先切除成层胶及需要进行凝胶直接染色的孔道部分，并将胶剪一小角作为定位标记，然后放在转移缓冲液中平衡30分钟左右。

（2）将转印膜1张及6张Whatman滤纸剪成与胶同样大小。转印膜用前需在转移缓冲液中平衡10～15分钟，滤纸用前在转移缓冲液中浸湿即可。

（3）由下至上将3层滤纸、膜、凝胶及3层滤纸依次放好。每放一层都应注意排除气泡。如有气泡，可用光滑的玻璃棒或试管在各表面缓慢滚动，予以排除。

（4）将转移装置连接好，接通电源。恒流下转移，0.8mA／cm2，转移30分钟至1小时。

（5）关闭电源，取出膜，然后用双蒸水漂洗l～2分钟，放在滤纸中干燥备用。注意膜上要做好标记。

2．检测

（1）将膜放在塑料盒中，加入适量封闭液，于37℃恒温振荡器上放置1小时，或4℃过夜。

（2）将膜转入塑料袋中，加入用封闭液稀释的第一抗体，于37℃或室温孵育反应1小时。

（3）剪开塑料袋，倾去第一抗体液体，用镊子将膜移至塑料盒中，加TBS洗3次，每次15分钟。

（4）加入稀释好的酶标第二抗体，继续在37℃或室温孵育反应30分钟至1小时。

（5）同步骤（3），洗膜。

（6）加底物显色液。此步骤一般要求避光进行。最好即时检查一下，以控制显色程度，防止本底过高及出现非特异条带。

（7）终止反应，用双蒸水大量冲洗，然后将膜放于双层滤纸中干燥保存。

注意事项

（1）如采用PVDF膜，使用前应在甲醇中浸泡一下，再移至转移缓冲液中平衡。另外，PVDF膜在检测时，采用TTBS缓冲液。

（2）电泳凝胶一般可重复转移1次，以获得两张相同的膜，第2次转移的时间可略延长。

（3）如待分析的蛋白质分子量大，转移时间也需延长。

（4）上述显色检测方法仅给出了基本步骤，采用不同检测系统，需按厂家说明书具体操作。

（5）电泳转移操作时，保证滤纸、膜、凝胶其间无气泡存在是实验的关键步骤。因即或有微小的气泡残留，电泳时局部温度升高，气泡膨胀会严重影响印迹结果。

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