免疫印迹技术

八、转印后切取印迹膜

有时转印后需将印迹剪成较小的片状进行单独处理。单个泳道可以泳动同一样品，待彼此分开后，可用不同的抗体并列检测。如以电泳方向剪膜，就可在同一样品中检测不同分子大小的抗原。为了简便而精确地找到泳道，电泳之后用丽春红S（Ponceaus S）或印度墨汁对印迹膜进行染色，便可很快确定待测蛋白质的位置并将其剪下。表3表明两种染料的适用范围及优缺点，用丽春红S染色的优点是操作简便，价廉和具有可逆性，在封闭过程中，染色易消褪，且不干扰进一步的检测。

在某些情况下，可能想用印迹中的较高分子量区域来检测一种抗原，用另一个区域来检测另一不同分子量的蛋白质。为了使印迹中不同的区域正好对应于相应分子量的范围，这需要在对照泳道中加入已知分子量的蛋白质。这样可方便地在印迹中找到适当的区域并将其剪下。

使用预染的分子量标记，可为转印后切下所需印迹提供良好的指示，此类标记已商品化，但是比丽春红S染色法昂贵。标记中的颜色除了增加成本对实验并无不良影响，而且在泳动时非常漂亮。

表3 用于免疫印迹染色的染料

印迹膜蛋白染色

[所需试剂]

（1）2%丽春红S浓贮存液（3-羟基-4-[2-磺基-4-硫代-苯偶氮基]-2，7—萘二磺酸）：溶于30%三氯醋酸和30%磺基水杨酸中。贮存液可在室温下稳定存放1年以上。

（2）PBS。

[操作步骤]

（1）在染色之前，先配制丽春红S的应用液。即将2%的丽春红S浓贮存液用1%醋酸1:10稀释即成为应用液（注意：如果使用硝酸纤维膜，须将丽春红S应用液更换为用水1:10稀释）。

（2）用丽春红S应用液将PVDF膜洗1次。

（3）加入新鲜稀释的丽春红S应用液，并在室温下搅动5～lOmin。

（4）将PVDF膜放人PBS中漂洗数次，每次1～2min，并更换PBS。

（5）根据需要将转印部位和分子量标准位置进行标记，至此PVDF膜可用于封闭和加入抗体。

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