免疫印迹技术

十、抗体的性质

影响免疫印迹成败的一个主要因素是抗原分子中可被抗体识别的表位的性质。只有那些能识别耐变性表位的抗体可与抗原结合。多数多克隆抗血清中或多或少地含有这种类型的抗体，所以在免疫印迹实验中常选用多克隆抗体。相反，许多单克隆抗体不能与变性抗原反应，因为它识别的表位依赖于抗原蛋白正确折叠所形成的三维空间构象。表5显示各种抗体的优缺点。

抗ENA抗体谱

ENA（extractable nuclear antigens）是可提取核抗原的总称，ENA抗原可用盐水或磷酸盐缓冲液从细胞核中被提取。ENA属非组蛋白的核蛋白；为酸性蛋白抗原，是由许多小分子RNA（约100-215个核苷酸）与各自对应的特定蛋白质组成的核糖核蛋白颗粒，该组成使其各自的抗原性得以增强，分子中不含DNA。ENA抗原中主要包括Sm、RNP、SSA、SSB、Jo-1、Scl-70抗原，这些抗原除有各自的抗原特异性外，尚可因与蛋白质组成后的分子量大小各不相同而在电泳后被分成不同分子量的条带。不同的自身免疫性疾病可产生不同的抗ENA抗体。根据ENA抗原分子量及抗原特性不同，可用不同的免疫方法对这些自身抗体进行检测。不同特性的抗ENA抗体在各种自身免疫性疾病中的阳性率有明显差异，有些有很高的特异性。对其进一步检测，在协助诊断和鉴别诊断自身免疫性疾病方面具有重要的临床意义。

抗ENA抗体的检测

检测抗ENA抗体谱的方法较多，早期常用的方法有双向免疫扩散（ID）、对流免疫电泳（CIE），但敏感度和特异性较低。目前临床检测最常用的方法有免疫印迹技术（IBT）和斑点酶免疫技术（dot-ELISA）。

免疫印迹技术（immunoblotting）属于膜载体酶免疫技术，其固相载体为吸附有抗原的硝酸纤维膜；基本原理是将从小牛或兔胸腔提取的ENA抗原，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），按分子量大小分离成区带，经参照对应分子量标准物质确定每一抗原区带的分子量。然后将各抗原区带转印至硝酸纤维膜上制成抗原吸附载体膜。将待检血清加在已切成细条的硝酸纤维膜上，待检血清中存在的抗ENA抗体分别与硝酸纤维膜上的相应抗原区带结合，当再加入酶标记抗人IsC抗体后形成抗原—抗体-酶标记抗体复合物，再加入酶的底物，出现显色反应，凡有抗ENA抗体与膜上抗原结合的位置，均会因酶促反应而显色。参照此时抗原区带的分子量及各区带的相对位置，可辨读出各特异性抗ENA抗体（图6）。该检测方法已有规范生产的试剂盒，从而有质量保证。

由于免疫印迹方法不需纯化的单个抗原，并可在同一载体上作多项抗原分析，灵敏度高，特异性强，操作简便，是目前各临床实验室广泛采用伪检测抗ENA抗体谱的方法。

抗ENA抗体的临床意义

1．抗Sm抗体 抗Sm抗体仅发现于SLE患者中，是SLE的血清标志抗体，已列入SLE的诊断标准。约30％—40％的SLE患者抗Sm抗体阳性，此抗体阴性不能排除SLE的诊断。相对抗dsDNA抗体而言，抗Sm抗体水平不与SLE疾病的活动性相关，亦不与SLE的任何临床表现相关，治疗后的SLE患者也可存在抗Sm抗体阳性。抗Sm抗体的检测对早期、不典型的SLE或治疗后的回顾性诊断具有很大帮助。

2．抗核RNP抗体 抗核RNP（nuclear RNP，nRNP）抗体是诊断MCTD的重要血清学依据，列入MCTD的诊断标准。因其抗原为含有U1RNA的核蛋白复合物，故而称为U1RNP。其在MCTD患者的阳性检出率可高达95％。无论在疾病的活动期或是缓解期，高滴度的抗RNP抗体均可持续存在。

抗nRNP抗体无疾病特异性，在其他自身免疫性疾病中阳性检出率如下：SLE 30％-40％， SS 20％，进行性系统性硬化（PSS）10％-15％，皮肌炎（PM）／多发性肌炎（DM）10％，偶尔也可 见于RA和药物诱发的狼疮，不过滴度均较MCTD患者低。

由于Sm和RNP是同一分子复合物（RNA-蛋白质颗粒）中的不同抗原位点，两种抗原具有相关性，故抗sm抗体阳性常伴有抗RNP抗体阳性，单一的抗sm抗体或抗RNP抗体阳性较少见。

3.抗SSA/Ro抗体和抗SSB/La抗体 抗SSA/Ro抗体和抗SSB/La抗体是SS患者最常见的自身抗体。其阳性检出率分别是70%～80%和40%，而抗SSB/La抗体的特异性高于抗SSA/Ro抗体，可达50％-60％。

该两个抗体的同时检测可提高对SS的诊断率。

部分SLE患者也有抗SSA／Ro抗体和抗SSB／La抗体的检出，其阳性率分别为35％和15％左右。约60%的亚急性红斑狼疮（SClE）患者，补体缺陷的SLE患者和新生儿狼疮患者可出现SSA/Ro抗体阳性抗SSA抗体可通过胎盘进入胎儿，引起新生儿狼疮综合征，出现典型的SLE皮损和不完全性心脏传导阻滞。

另外，单独出现抗SSA/Ro抗体阳性的SLE患者，其肾炎或血管炎的发生率单独出现SSB/La抗体的SLE患者高。

因SSA/Ro抗体与SSA/Ro抗原形成的免疫复合物，更易沉积于肾脏和血管壁，造成肾脏损伤及血管炎。

4.抗Jo-1抗体 该抗体最常见于多发性肌炎（polymositis，PM），故又称为PM-1抗体。具有抗Jo-1抗体特性的是分子量110kD和（或）80kD的多肽（核仁蛋白）。抗Jo-1抗体在PM的阳性检测率可达40％-50％，在PM/DM患者的阳性检出率为25％，单独皮肌炎中的检出率不足10％，在其他自身免疫性疾病中抗Jo-1抗体为阴性，因而抗Jo-1抗体对PM诊断刚具有特异性。

PM与硬皮病重叠的患者，抗Jo-1抗体的阳性率可高达85％，PSS／PN中为25％，PM伴肺间质纤维化者抗Jo-1抗体阳性率可达60%。

5.抗scl-70抗体 抗Scl-70抗体几乎仅在进行性系统性硬皮病（progressive systemic sclerosis PSS）患者中检出，抗体相对应的抗原分子量为70kD。故该抗体是PSS的特征性抗体。在系统性硬化症的阳性检出率为20%~40%，在PSS的阳性检出率为40%~60%。在其他自身免疫性疾病患者中极少有阳性检出，正常人均为阴性。

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